Ciência e Futuro : Outros laboratórios tentaram fazer bacteriófagos, mas nenhum conseguiu construir um totalmente sintético. Você pode nos explicar como seu método permitiu esse feito?
Greg Lohman: Nossa abordagem é bastante flexível e rápida em comparação com os métodos existentes. Usando o Golden Gate Assembly, você pode projetar montagens confiáveis de dezenas de fragmentos de DNA por vez. Você pode cortar o genoma de um fago, que tem entre 20.000 e 60.000 pares de bases, em 12 ou 24 fragmentos. Isto os reduz a um tamanho pequeno o suficiente para ser sintetizado diretamente usando métodos simples, que podem ser encomendados a um fornecedor.
Os fragmentos são curtos o suficiente para serem facilmente clonados na bactéria Escherichia colique copia fragmentos de DNA em grandes quantidades com altíssima fidelidade. Então, a partir dessas sequências clonadas, é possível montar o fago inteiro em uma única reação que leva cerca de um dia e não requer um hospedeiro especializado.
Outra dificuldade em fazer isso foi que os genomas dos bacteriófagos contêm muitas seções que são altamente tóxicas para E.coli. Tivemos, portanto, que recorrer a métodos alternativos, como a síntese por PCR, que apresentam taxas de erro aleatório muito mais elevadas. Mas hoje as peças são pequenas o suficiente para que você possa projetá-las de forma que não sejam tóxicas para E.coli. Por exemplo, removendo genes tóxicos para que não possam produzir proteínas tóxicas.
O processo é extremamente preciso e comete no máximo um único erro em todo o genoma. Também é muito flexível: os fragmentos são pequenos o suficiente para serem manipulados usando métodos muito tradicionais de biologia molecular, permitindo que múltiplas alterações sejam feitas em diferentes locais do genoma ao mesmo tempo. Também demonstramos que poderíamos integrar material genético adicional, por exemplo, para adicionar um marcador fluorescente.
“Esta ferramenta de biologia sintética abre muitas possibilidades”
O que pode ser útil adicionar a um fago para torná-lo mais funcional?
Paulo Turner: A verdadeira vantagem desta técnica é que ela abre novas perspectivas no campo da biotecnologia. Mesmo a introdução de marcadores fluorescentes modestos seria útil para diagnóstico e monitoramento. Se você rotulou os fagos, poderá detectá-los mais facilmente quando atingirem seus alvos. E se esses alvos estiverem num organismo vivo, como um ser humano, você tem a tecnologia certa para detectá-los. Ou, para detectar possível contaminação, por exemplo, de bioterrorismo num curso de água utilizado para consumo humano. Neste caso, você se beneficiaria com uma maneira muito rápida de usar o fago marcado para determinar rapidamente e em tempo real a presença de uma bactéria. O fato é que esta ferramenta da biologia sintética abre muitas possibilidades para diferentes tipos de fagos.
Voltando a este método, ele já foi utilizado para outros tipos de vírus, por exemplo, ou para outras aplicações da biologia sintética?
Greg Lohman: Golden Gate é uma técnica amplamente utilizada em biologia sintética para muitas aplicações diferentes. A principal inovação feita pelo meu laboratório por volta de 2018 foi definir novas regras de design permitindo maior flexibilidade e complexidade. As aplicações mais comuns do Golden Gate usam os chamados padrões, que podem ser comparados aos Legos: você tem um conjunto de conexões padronizadas que usa continuamente. Com regras de design mais flexíveis, você pode não apenas usar mais peças, mas também colocar conexões onde quiser no seu sistema atual. Você encontra as melhores conexões para usar, independentemente do sistema.
Paulo Turner: A capacidade desta tecnologia de montar elementos é o objetivo da biologia sintética. Estamos vendo vírus naturais que parecem ser combinações de vírus diferentes. Seria ótimo alcançar essa modularidade em fagos, onde os elementos poderiam ser movimentados no espaço genético e genotípico e realmente funcionar quando colocados juntos. Portanto, os tipos de ferramentas e abordagens nas quais Greg trabalha aqui são extremamente importantes para conseguir isso.
Greg Lohman: Também é possível alterar o intervalo de hospedeiros de um fago. No artigo, fizemos algumas trocas das fibras utilizadas pelos fagos para reconhecer seu alvo. Ao modificá-los, podemos alterar o intervalo de hospedeiros do fago. É então possível criar um fago capaz de cobrir uma gama mais ampla de cepas bacterianas alvo.
Paulo Turner: Sabemos que alguns fagos são naturalmente um pouco como canivetes suíços. Suas fibras diferem umas das outras, provavelmente porque o único fago é capaz de interagir com diferentes alvos de ligação. Este tipo de tecnologia poderia, em princípio, criar fagos que se assemelhassem mais aos que existem na natureza e que se assemelhassem um pouco a estes canivetes suíços.
“Uma série de desafios técnicos a superar”
Como podemos ter certeza de que o fago não evoluirá e tentará atacar as bactérias do nosso microbioma?
Paulo Turner: Muitas vezes me fazem essa pergunta. Seu microbioma já está repleto de fagos capazes de atacar essas bactérias. É pouco provável que os fagos geneticamente modificados que têm como alvo uma espécie específica de bactéria patogénica se tornem mais eficazes do que os fagos pré-existentes que evoluíram ao longo de milhares de milhões de anos para infectar bactérias no microbioma. Além disso, já utilizamos medicamentos químicos tradicionais que atacam em grande parte o microbioma. Mesmo os antibióticos de espectro estreito têm um alcance mais amplo do que qualquer fago que possamos criar.
Greg Lohman: A segurança e o impacto ambiental de qualquer organismo geneticamente modificado devem ser cuidadosamente considerados. Não sou bioeticista nem especialista em biossegurança, mas é algo que considero muito importante quando se trata de implementar coisas no mundo real. Mas penso que também precisamos de considerar a alternativa, que neste caso é o uso excessivo generalizado de antibióticos, que tem consequências de longo alcance para o paciente, mas também para o ambiente e para o microbioma global.
Na verdade, acho que o uso de fagos modificados facilita a realização de estudos de segurança muito rigorosos, porque os genomas editados terão certos marcadores. Você pode até adicionar marcadores intencionais para rastrear seu fago e saber, por exemplo, se ele entrou no ambiente.
Paulo Turner: O código de barras e outros recursos oferecidos por essa tecnologia facilitam muito essa tarefa.
Agora que você tem esse método e funciona, você acha que pode ser melhorado?
Greg Lohman: Estou convencido de que para qualquer patógeno podemos encontrar um sistema fago que podemos transformar em um desses sistemas projetados. Mas seria interessante determinar os limites da tecnologia actual e ver se conseguimos ultrapassá-los. Por exemplo, não sabemos se podemos usar fagos maiores, que podem ter genomas de 100 a 200 kb. Ou fagos ainda maiores, como os fagos jumbo recentemente descobertos, que atingem o tamanho de um genoma bacteriano inteiro. Atualmente, essas duas classes estão além do que podemos montar com o Golden Gate. O limite superior da biologia sintética comum, pelo menos na biologia bacteriana, é de cerca de 100 quilobases. Há uma série de desafios técnicos a serem superados para que esta abordagem possa ser aplicada à maior variedade possível de fagos.
“A meio caminho entre o vivo e o não vivo”
Qual seria o propósito da criação desses grandes fagos?
Greg Lohman: Primeiro, para entendê-los melhor. As pessoas não sabem muito sobre esses fagos gigantes. Eles são muito estranhos, a meio caminho entre os vivos e os não vivos, porque têm muito mais mecanismos, mas ainda dependem em grande parte de um hospedeiro. E existem muito poucas ferramentas para trabalhar com estes organismos.
Quanto aos fagos de tamanho intermédio, penso que poderiam ser utilizados como ferramentas biotecnológicas, não necessariamente para fins clínicos, mas apenas para resolver alguns dos problemas de manipulação e montagem de ADN nesse tamanho. Poderíamos usá-los para ajudar a mover o DNA na biologia molecular e manipulá-lo fora das células.
Além disso, quanto maior o fago, mais espaço existe para adicionar os componentes desejados ao fago. genoma, para encontrar os elementos a serem removidos, para liberar mais espaço para adicionar as cargas genéticas que você deseja entregar. O tamanho físico maior oferece mais espaço para fazer coisas, como conjugar um antibiótico ao fago, o que poderia permitir que os fagos transportassem um antibiótico para aquilo que você deseja matar.
Finalmente, quase todas as enzimas mais utilizadas na biologia molecular provêm de interações entre fagos e seus hospedeiros, seja dos próprios vírus ou de mecanismos de defesa bacterianos, sejam enzimas de restrição ou polimerases que usamos para fazer vacinas de mRNA. Todas essas descobertas vieram da compreensão da biologia dos fagos e de como as células hospedeiras respondem à infecção por fagos. Portanto, é difícil dizer o que descobriremos usando essas ferramentas.
Paulo Turner: Este método poderia nos ajudar a entender melhor os fagos e, por exemplo, encontrar fagos capazes de tornar as bactérias mais sensíveis aos antibióticos. A sinergia entre fagos e antibióticos pode ser maravilhosamente transformadora, mas, francamente, não compreendemos como funciona mecanicamente. Precisamos de ferramentas melhores para fazer isso, e isso ajudaria. Se encontrarmos ou desenvolvermos fagos que funcionem melhor em sinergia com os antibióticos, isso ampliará a utilidade do nosso pipeline de antibióticos químicos existente, contrariando os piores cenários da crise de resistência aos antibióticos.